在ELISA實(shí)驗(yàn)中，樣本值低于空白值是一個(gè)經(jīng)常性的問(wèn)題。當(dāng)樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發(fā)生樣本值低于空白值的現(xiàn)象，特別是在血清和血漿樣本的檢測(cè)。究其原因，主要在于兩個(gè)方面，一方面是誤差，另一方面是基質(zhì)效應(yīng)。下文逐個(gè)分析不同影響因素的原理、和解決方案。
一、基質(zhì)效應(yīng)
分析中，基質(zhì)指的是樣本中被分析物之外的組分，基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱(chēng)為基質(zhì)效應(yīng)。ELISA試劑盒在開(kāi)發(fā)過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)品不能采用人或動(dòng)物血清、血漿作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液，只能采用其模擬物。模擬物與被測(cè)樣本在蛋白豐度、復(fù)雜性、pH等因素都會(huì)存在差異。當(dāng)樣本的基質(zhì)與其模擬物相比，降低抗原抗體的結(jié)合，便產(chǎn)生了樣本值低于空白值的現(xiàn)象。造成樣本值無(wú)法計(jì)算出數(shù)值，或者數(shù)值為負(fù)。
目前zui常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是，通過(guò)已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，同時(shí)盡可能保持樣本中的基質(zhì)不變，建立一個(gè)校正曲線。
二、誤差
誤差分為三類(lèi)：系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。這三類(lèi)誤差中，系統(tǒng)誤差對(duì)樣本值和空白值之間的差異無(wú)影響。ELISA樣本值低于空白值在誤差方面主要來(lái)源于隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。
1、 隨機(jī)誤差
無(wú)法控制的變因，使測(cè)量值產(chǎn)生隨機(jī)分布的誤差，服從統(tǒng)計(jì)學(xué)上的正態(tài)分布。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上來(lái)看，測(cè)量值有99%的置信限在±3SD之間，如果CV值是20%，隨機(jī)誤差的邊界就是±60%，也就是說(shuō)在CV值20%的狀況下，樣本值低于空白值60%之內(nèi)，有可能是隨機(jī)誤差的影響，特別是空白值只有一個(gè)值時(shí)。
隨機(jī)誤差不可消除，只能通過(guò)多次測(cè)量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機(jī)誤差的解決方案1是增加空白值的重復(fù)數(shù)量，一般認(rèn)為空白值重復(fù)10次，測(cè)量均值接近真值。
方案2是提高實(shí)驗(yàn)技能，也能夠有效降低隨機(jī)誤差的影響。如果CV值在5%，樣本值趨近于零時(shí)，在統(tǒng)計(jì)上樣本值將不會(huì)低于空白值15%。
2、 過(guò)失誤差
過(guò)失誤差主要是由于測(cè)量者的疏忽，犯了不應(yīng)有的錯(cuò)誤造成的。過(guò)失誤差是可以避免的。針對(duì)于ELISA樣本值低于空白值的問(wèn)題，過(guò)失誤差產(chǎn)生的原因多數(shù)來(lái)源于空白孔HRP的重復(fù)加樣或污染或洗滌不干凈，造成空白值偏高，相對(duì)比來(lái)說(shuō)，樣本值低于空白值。解決方案就是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，規(guī)范操作。
當(dāng)單個(gè)樣本或少量樣本值低于空白值時(shí)，可能是誤差原因，這時(shí)應(yīng)增加重復(fù)，提高操作技能。當(dāng)大量樣本都低于空白值時(shí)，應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，建立校正曲線予以修正。
